ABI 熒光定量儀基于實時熒光定量 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）技術。在 PCR 擴增過程中，隨著特定熒光染料與擴增產物結合，熒光信號強度會伴隨產物數量的增加而增強。儀器通過實時監測熒光信號，依據熒光信號達到設定閾值時的循環數（Ct 值），精準推算出初始模板的含量。為讀者全面呈現這一先進儀器的魅力。以下是ABI熒光定量PCR的一般操作步驟：

1. 準備工作：設計并合成引物和探針（若為探針法），準備好模板DNA、熒光定量PCR試劑、無菌水、離心管、移液器等實驗器材。

• 開機與軟件啟動：先開電腦，再開儀器，最后打開軟件。

• 實驗設置

– 雙擊桌面圖標，進入主界面后選擇“advanced setup”。

– 默認進入“setup”下的“experiment properties”界面，輸入實驗名稱，確認儀器型號，在實驗類型中，選擇“quantitation – comparative ct（△△ct）”等，選擇試劑種類（如探針法或染料法）。

• 編輯基因及樣本

– 進入“setup”下的“plate setup”界面，在“define targets and samples”界面中設置基因及樣品。利用“add new target”添加新的基因，并在“target name”中編輯基因名稱，若是SYBR Green法，默認FAM通道即可；若是探針法，需在“reporter”和“quencher”中選擇所標記的熒光基團及淬滅基團。還可利用相關按鈕保存或刪除已添加的基因。利用“add new target”添加新的樣本，并編輯樣品名稱。

– 在“assign targets and samples”界面中進行樣品板的排布。利用鼠標單擊或拖拽以選擇反應孔，然后勾選左側的基因及樣本，同時在“task”選項中指定該反應孔類型（U代表未知樣本，N代表陰性對照，P代表陽性對照）。 – 在“select relative quantitation setting”中設置內參基因及對照樣本。

• 設定反應條件及體積：進入“run method”界面，更改溫度及時間，確認所示圖標為點亮狀態，以保證信號正常采集。根據所使用的試劑和引物等優化反應條件，包括變性、退火、延伸的溫度和時間等。

• 保存并運行實驗：點擊“save”，將文件儲存成“experiment document single files（*.eds）”格式，然后在“run”界面按下“start run”按鈕，反應即開始進行。

• 結果分析

– 實驗結束后，點擊界面右上角的“analyze”按鈕，軟件將會顯示實驗結果。 – 在擴增圖中，可通過更改“plot settings”來改變擴增圖的顯示方式。如果想查看閾值線或基線，請將“threshold”及“baseline”打勾。

– 查看相對表達量結果時，利用“plot settings”選項，可以以不同方式顯示相對表達量的結果。

– 對于SYBR Green法實驗，可以在“melt curve”界面中查看熔解曲線，幫助確定產物類型，判斷是否有非特異性擴增。

– 檢測“qc summary”結果，可以快速查看實驗中是否有反應孔存在異常情況。黃色三角形中的數字代表異常情況的種數，詳細信息及解決方案可以在“flag details”中看到。

8. 數據導出與保存：分析之后的結果，可以利用菜單中的“file > export”功能，導出Excel格式的結果。若想存儲圖片結果，可直接在圖片上單擊鼠標右鍵，選擇“save as”，存成JPEG格式的圖片，也可以直接按相機圖標保存。